Rampampam
Пользователь
- Сообщения
- 10
- Баллы
- 1
Влияние мефедрона на клетки нейробластомы и астроцитомы человека
Мефедрон — это нелегальное психоактивное вещество, используемое в рекреационных целях. На данный момент было проведено немного исследований, направленных на изучение механизмов, посредством которых мефедрон воздействует на клетки. В данном исследовании было изучено влияние мефедрона с использованием токсикологии в сочетании с метаболомикой на основе ЖХ/МС/МС на двух клеточных линиях, производных от ЦНС. Методы оценки, такие как анализ с нейтральным красным (NR), бромидом диметилтиазолилдифенилтетразолия (MTT), измерение лактатдегидрогеназы (LDH) и морфология, были использованы для определения влияния на жизнеспособность клеток и для определения оптимальной концентрации для исследования метаболомики. В метаболомическом эксперименте использовалась концентрация мефедрона 100 мкМ, при которой наблюдались значительные внутриклеточные изменения, хотя явных признаков повреждения клеток мефедроном не было. В астроцитах было четко показано, что функция клеточной мембраны может быть нарушена из-за истощения эфирных липидов.
Введение
Мефедрон — это синтетический катинон, замещенный в бензольном кольце, 4-метилметкатинон. Поскольку мефедрон химически схож с амфетаминами, ожидается, что он будет увеличивать концентрации дофамина (ДА) и серотонина (5-НТ) в мозге аналогичным образом, как это делают амфетамины. В данном исследовании токсичность мефедрона на человеческих нейрональных клетках оценивалась с использованием метаболомики. Это первое исследование токсичности мефедрона с использованием метаболомического подхода.
Материалы и методы
Подготовка мефедрона
4,43 мг гидрохлорида мефедрона (чистота более 98%) растворяли в 2% уксусной кислоте (0,5 мл), получая раствор мефедрона 50%, который затем разбавляли в среде для получения других концентраций. Раствор мефедрона хранили при −20 °C до экспериментов.
Извлечение лизатов клеток для метаболомики
В исследовании применялись клетки человеческой астроцитомы (U373) и нейробластомы (SH-SY5Y) из Европейской коллекции клеточных культур. Среду удаляли из лунок, клетки промывали дважды 0,5 мл предварительно нагретого PBS (37 °C). 200 мкл охлажденного экстракционного раствора (50% метанола, 30% ацетонитрила и 20% воды) добавляли в каждую лунку для лизиса клеток. Полученный клеточный раствор переносили в пробирки Eppendorf объемом 0,5 мл. Образцы встряхивали при 4 °C в течение 12 мин, затем центрифугировали при 0 °C и 13000 об/мин в течение 10 мин. Сверхчистую фракцию переносили в стеклянные виалы и хранили при −80 °C до анализа с помощью ЖХ-МС.
Оценка жизнеспособности клеток
Анализ нейтральным красным (NR)
Метод был взят из ранее опубликованного метода (Inoue et al., 2001). После инкубации с мефедроном среду удаляли, и в каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 100 мкл раствора NR (0,05 мг/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS)). Планшет инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 3 ч. Раствор удаляли после инкубации, лунки промывали 200 мкл PBS. Добавляли 100 мкл деколирующего раствора (смесь 50 мл этанола, 1 мл ледяной уксусной кислоты и 49 мл дистиллированной воды), планшет оставляли на шейкере на 30 мин. Поглощение измеряли при 540 нм с помощью спектрофотометра для планшетов (Multiskan GO, Thermo Scientific). Анализ NR является хорошим индикатором роста клеток.
Анализ бромидом диметилтиазолилдифенилтетразолия (MTT)
Анализ MTT проводили в соответствии с методикой (Borenfreund и Puerner, 1985). Раствор MTT 10 мМ готовили в PBS и фильтровали через фильтр 0,2 мкМ. В каждую лунку добавляли 50 мкл раствора после окончания инкубации. Планшет инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 4 часов. После инкубации раствор MTT удаляли и в каждую лунку добавляли 200 мкл ДМСО. Раствор в каждой лунке перемешивали для равномерного окрашивания и переливали в кювету объемом 1 мл. Поглощение измеряли при 540 нм с помощью спектрофотометра для планшетов (Multiskan GO, Thermo Scientific). Анализ MTT является индикатором клеточного метаболизма.
Анализ лактатдегидрогеназы
Анализ LDH основан на способности LDH восстанавливать никотинамидадениндинуклеотид (NAD) до NADH. Это хороший индикатор для оценки повреждения мембраны клеток. NADH будет восстанавливать тетразолиевую соль 2-(4-йодофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-фенил-2H-тетразолий (INT) до красного формазана. Для каждого измерения в кювету (объемом 1 мл) добавляли 0,86 мл 0,1 М буфера фосфата натрия (pH 7,6) и 40 мкл раствора пировиноградной кислоты (3 мг в 1 мл NaPi буфера)/NADH. Затем добавляли 100 мкл среды из каждой лунки. Изменение поглощения регистрировали при 340 нм с помощью УФ-спектрофотометра (UV-2401PC, Shimadzu) в течение 60 секунд при комнатной температуре.
Морфология
Клетки изображали после 6 дней инкубации с мефедроном и без него с использованием микроскопа Motic AE31 с сухими линзами увеличения 20x. Любые изменения в клеточной мембране или внутриклеточных компонентах контролировались.
Результаты
Влияние мефедрона на жизнеспособность, измеренное с помощью анализов MTT, NR и LDH
Анализ MTT
Для изучения влияния мефедрона на клеточную метаболическую активность проводили анализ MTT на обеих клеточных линиях (нейробластома и астроцитома) после обработки различными концентрациями мефедрона в течение 48 часов.
Анализ NR
Обе клеточные линии (нейробластома и астроцитома) обрабатывали различными концентрациями мефедрона в течение 48 часов, и проводили анализ NR для оценки влияния на количество клеток.
Анализ LDH
Из результатов анализа LDH для клеток нейробластомы и астроцитомы после обработки 100 мкМ мефедрона в течение 6 дней можно сделать вывод, что значимых различий в активности LDH между обработанными мефедроном клетками и необработанными в обоих типах клеток не наблюдалось.
Влияние на морфологию
Визуальное исследование под микроскопом обоих типов клеток (нейробластома и астроцитома) до и после обработки 100 мкМ мефедрона в течение 6 дней показало отсутствие признаков аномального размножения после обработки мефедроном.
Морфология клеток SH-SY5Y (A и B) и U373 (C и D) после 6-дневной инкубации без обработки мефедроном (A и C) и с мефедроном (B и D). Фотографии были сделаны с помощью микроскопа Motic AE31 с сухими объективами на 20-кратном увеличении.
Метаболомический анализ
Метаболомический анализ обработанных клеток показал значительные изменения в метаболитах в обоих типах клеток после обработки мефедроном.
Метаболомические исследования на клетках нейробластомы после обработки 100 мкМ мефедрона на протяжении 6 дней показали значительные изменения.
Анализ методом ортогонального частичного наименьших квадратов с дискриминацией (OPLS-DA) — хороший параметр для диагностики различий между двумя группами с использованием многомерного анализа. По его результатам можно сделать вывод, что обработка мефедроном привела к значительным изменениям в метаболоме обработанных образцов по сравнению с метаболомом необработанных образцов.
Пермутационный анализ модели OPLSDA для клеток астроцитомы, обработанных мефедроном и необработанных. Валидация модели проводилась с использованием 100 пермутационных тестов. R2 представляет качество подгонки, а Q2 — предсказательную способность
В клетках SH-SY5Y, обработанных мефедроном, наблюдалось значительное увеличение цистеина глутатион дисульфида, который образуется в результате окислительного стресса. Окисление глутатиона приводит к образованию смешанных дисульфидов с тиоловыми группами белков, инициируя обратимое S-глутатионирование. S-глутатионирование важно для передачи сигналов окислителей, отключая фермент эндотелиальную синтазу оксида азота (eNOS) для регулирования его активности в производстве O2•− вместо NO.
Используя модель OPLSDA, удалось разделить обработанные и контрольные образцы, и модель была признана действительной в соответствии с тестом перекрестной проверки и статистикой CVANOVA.
МТТ-тест, измеренный в клетках (A) SH-SY5Y и (B) U-373 через 48 часов. Результаты выражены в процентах (Среднее ± SD, n = 6), где 100% соответствует контрольным значениям. Клетки обрабатывали мефедроном в культуральной среде на протяжении всего эксперимента. Данные были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), после чего проводился тест Тьюки. * Данные значительно отличались от соответствующих контрольных значений, P < 0.05
Можно сделать вывод, что обработка мефедроном привела к более значительным изменениям в метаболоме обработанных образцов астроцитомы по сравнению с метаболомом необработанных образцов астроцитомы. Эффекты в этой клеточной линии являются более очевидными, чем в клетках нейробластомы.
Кроме низкомолекулярных метаболитов, наблюдается множество изменений в липидах в астроцитах, вызванных обработкой мефедроном Многие липиды уменьшились в клетках в результате обработки. Это можно увидеть на тепловой карте, где даже некоторые очень распространенные липиды изменились.
Одним из наиболее заметных эффектов на астроциты оказалось воздействие на эфирные липиды, которые не особенно распространены в клетках, но имеют важное значение для текучести мембраны и защитного действия в отношении миелина от окислительного стресса. Некоторые эфирные липиды (LPE 18:1 эфир, ПК 38:5 эфир, LPC 36:4 эфир, ПК 36:3 эфир и ПК 32:1 эфир) в клетках были практически полностью истощены. У мышей и человеческих пациентов с дефицитом эфирных липидов развивались проблемы с миелинизацией в ЦНС.
Несколько липидов были уменьшены. Глицерофосфолипиды являются основным компонентом клеточной мембраны. Считается, что клетки изменяют клеточную мембрану в качестве защитной реакции при воздействии экстрацеллюлярных токсичных соединений. Глицерофосфохолины контролируют баланс между концентрацией растворенных веществ внутри и снаружи клетки. Предыдущее исследование показало, что уровни ПК уменьшились в мозге мыши после обработки антидепрессантами (пароксетином и мапротилином). В другом исследовании снижение глицерофосфолипидов было связано с окислительным стрессом и изменениями в липидной мембране клетки. Предполагается, что окислительный стресс повлиял на состав клеточной мембраны в клетках, обработанных мефедроном.
Интересно, что окислительный стресс, вызванный хроническим непредсказуемым стрессом, был показан как фактор, нарушающий уровни фосфолипидов в мозге мыши. В другом исследовании, проведенном на гиппокампе и префронтальной коре крыс, четыре недели хронического непредсказуемого стресса привели к значительному снижению уровней ПЭ. Окислительный стресс вызывает окисление липидов, что ведет к изменению липидного баланса, связанного с неврологическими расстройствами. Окисление липидов приводит к дестабилизации мембраны клеток и затем к гибели клеток. Это исследование предполагает, что мефедрон может снижать глицерофосфохолин из-за окислительного стресса, поскольку эффекты мефедрона ранее были связаны с окислительным стрессом.
Другие измененные мембранные липиды включают глицерофосфолипиды (ФГ), фосфатидилсерины (ФС) и сфингомиелины (СМ), которые также уменьшились. Все эти липиды являются частью клеточной мембраны, поэтому снижение этих липидов является признаком повреждения мембраны. Несколько лизофосфолипидов также были изменены. Поскольку известно, что лизофосфолипиды имеют нейропротективную роль, любое их снижение повлияет на защитные способности нейронов.
Кроме того, сфингомиелины также были затронуты обработкой. Сфингомиелин 36:2 уменьшился, и это тип сфинголипида, находящегося в миелиновой оболочке мембраны, которая покрывает аксон нервной клетки.
Три сфинганина уменьшились, и они играют роль в блокировании этерификации липопротеина низкой плотности холестерола, что приводит к накоплению неэтерифицированного холестерола в перинуклеарных везикулах. Сфинганины являются эффективным сигнальным липидом или липидным мессенджером, который прикрепляется к целевому белковому рецептору, что способствует функции липида в определенных ответах клетки. Можно сделать вывод, что снижение сфинганинов повлияет на липидную сигнализацию в клетке.
Девять жирных кислот были затронуты, две увеличились, а семь уменьшились. Астроциты (представленные клетками астроцитомы) отвечают за перенос жирных кислот из плазмы в мозг и являются единственными клетками в мозге, которые могут окислять жирные кислоты и на самом деле предпочитают их в качестве топлива. Любой сбой в работе астроцитов приведет к нарушению уровней жирных кислот в мозге, а любое снижение уровней жирных кислот приведет к снижению функции астроцитов. Мефедрон может вызвать нарушение уровней жирных кислот в астроцитоме. Поскольку астроциты обеспечивают другие клетки мозга глюкозой и кетоновыми телами за счет своей способности окислять жирные кислоты, любое воздействие на них приведет к снижению энергоснабжения других клеток мозга.
Три метаболита карнитина уменьшились. Это L-карнитин, бутенилкарнитин и гидроксибутирилкарнитин. Карнитины имеют очень важную роль в обеспечении клеток энергией и жизненно важны для метаболизма жирных кислот.
Менаквинол-8 или витамин K2 уменьшился, что играет роль в регуляции свертываемости крови. Витамины K имеют одинаковую структуру метилированного нафтохинонового кольца и отличаются только типом боковой алифатической цепи, связанной на позиции 3.
Два гликогена увеличились в результате обработки. Гликоген — основной продукт запасания глюкозы в человеческих клетках. Гликоген находится в гранулярных структурах в цитозоле. Предполагается, что клетки произвели больше гликогена для компенсации потери энергии в условиях повреждения мембраны. В мозге гликоген преимущественно находится в астроцитах, где он служит источником энергии для защиты мозга от гипогликемии.
Другие метаболиты, связанные с метаболизмом глутамата, такие как 2-оксоглутарат, L-2-аминоадипат и D-глюкозамин-6-фосфат, также изменились. Окисленный глутамат (оксоглутарат) уменьшился на 60%, а другие увеличились. Аминоадипат, который был увеличен, является антагонистом возбуждающего эффекта глутамата и является метаболитом лизина. Глутамат является важным нейротрансмиттером, ответственным за быстрый возбуждающий эффект в мозге. L-аспарагин, который уменьшился, является метаболитом глутамата. Однако, мы не можем сделать вывод о влиянии на уровень глутамата, так как его уровень не изменился значительно.
Два метаболита, связанных с путями триптофана и серотонина, уменьшились. 5-гидроксииндолацетат является метаболитом нейротрансмиттера серотонина. Индоллактат также уменьшился, и это метаболит триптофана, предшественника серотонина и мелатонина. Однако мы не смогли обнаружить серотонин или триптофан в нашем методе.
Никотинамид и NADH также изменились с значимыми значениями p. NADH уменьшился, а никотинамид увеличился. Никотинамид играет важную роль в защите нейронов, так как предварительная обработка никотинамидом обратила вспять гипоксию в гиппокампе крыс. Таким образом, мы делаем вывод, что одним из механизмов защиты клеток астроцитомы является производство никотинамида для защиты их самих и нейронных клеток от окислительного стресса, вызванного обработкой мефедроном.
Модель PCA для контроля (коричневый), обработанных мефедроном (синий) астроцитов и объединённых образцов (зелёный).
Обсуждение
В тесте MTT оба типа клеток показали увеличение метаболической активности после обработки мефедроном. Клетки SH-SY5Y не показали увеличения в анализе NR в лунках с 100 мкМ. Напротив, в клетках U-373 наблюдалось увеличение активности для обоих анализов (NR и MTT), с более высоким увеличением метаболической активности. Это можно объяснить дополнительной защитной способностью U-373 увеличивать количество клеток, так как они представляют астроциты, которые играют роль в защите нейронных клеток.
Анализ NR не показал значимого влияния мефедрона на скорость роста клеток SH-SY5Y. Для клеток U-373 наблюдалось постепенное увеличение количества клеток по мере увеличения концентрации мефедрона до 300 мкМ. Рост клеток начал снижаться при концентрациях мефедрона 400 мкМ и 500 мкМ.
Тест с нейтральным красным, измеренный в клетках (A) SH-SY5Y и (B) U-373 через 48 часов. Результаты представлены в процентных значениях (Среднее ± SD, n = 6), где 100% соответствует контрольным значениям. Клетки обрабатывали мефедроном в культуральной среде на протяжении всего эксперимента. Данные были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), после чего проводился тест Тьюки. * Данные значительно отличались от соответствующих контрольных значений, P < 0.05
Измерение высвобождения LDH является хорошим индикатором повреждения клеток и целостности клеточной мембраны. Поскольку результаты показали, что не было значимого увеличения в обоих типах клеток, мы можем сделать вывод, что мефедрон при этой концентрации и времени воздействия не оказал сильного влияния на целостность клеточной мембраны в этих клетках.
Мы можем заключить из исследования морфологии, что не было значительных изменений в форме клеток в результате воздействия мефедрона при данной концентрации и времени экспозиции как в клетках SH-SY5Y, так и в клетках U-373. Это находится в противоречии с результатами исследования Холландера, особенно в клетках SH-SY5Y при концентрации 500 мкМ. Однако методология, используемая в исследовании Холландера, отличалась (использовался анализ WST-1), что также может быть объяснено различиями в числе пассажей, поскольку Холландер проводил исследование на клетках от 6 до 20 пассажей, в то время как в данном исследовании использовались клетки на пассажах выше 35.
Общее впечатление после метаболомического анализа заключается в том, что мефедрон не оказал сильного воздействия на клетки SH-SY5Y при этих концентрациях. Либо мефедрон воздействует на определенный тип клеток, отличный от нейробластомы, либо данная концентрация мефедрона не способна вызвать значимое воздействие на эту клеточную линию. Изменения метаболитов носят случайный характер и не вписываются в какой-либо конкретный путь, при этом изменения величин обычно невелики.
Также стоит отметить, что данные клеточные линии (SH-SY5Y) теряют свои дофаминергические способности после 20 пассажей, а анализ проводился на 35 и более пассажах, что делает эти клетки менее репрезентативными для нейронных клеток. Увеличение метаболической активности, наблюдаемое в результате анализа MTT (Рисунок 1), можно объяснить возможным увеличением специфических белков, которые не обнаруживаются метаболомическим анализом.
В клетках астроцитомы основное воздействие было оказано на липидный путь, особенно на липиды клеточной мембраны. Это открытие может помочь понять воздействие мефедрона на мозг, особенно на гематоэнцефалический барьер (астроциты). Воздействие на астроциты как важную часть мозгового барьера повлияет на нейроны, так как астроциты известны своей защитной ролью по отношению к нейронным клеткам. Однако мефедрон не оказал сильного цитотоксического эффекта при этой концентрации, хотя и вызвал изменения в метаболоме клеток ЦНС, что не отвечает за его токсичность в организме, так как количество клеток, как показано результатами анализа NR, не уменьшилось.
Метаболомический анализ подтвердил, что после обработки клеток SH-SY5Y и U373 мефедроном в концентрации 100 мкМ произошли изменения метаболизма, что согласуется с результатами анализа MTT. Результаты метаболомики обоих типов клеток предполагают увеличение концентрации глутамина после обработки мефедроном. Появление цистеинглутатион дисульфида в клетках SH-SY5Y после обработки мефедроном указывает на наличие окислительного стресса. Воздействие мефедрона было гораздо более заметным на клетках U373.
Заключение
Из анализа различных типов клеток очевидно, что, хотя мефедрон не убил клетки и не уменьшил их рост, он вызвал значительные внутриклеточные метаболические изменения. Считается, что даже небольшие изменения в гомеостазе клеток мозга могут привести к неврологическим заболеваниям. Хотя явных признаков клеточного повреждения, вызванного мефедроном, не было, в астроцитах было четко указано, что функция клеточной мембраны могла быть нарушена из-за истощения эфирных липидов. Рекомендуется использовать более высокие концентрации мефедрона на тех же клеточных линиях в будущем метаболомическом исследовании, чтобы лучше исследовать токсический эффект мефедрона.
Мефедрон — это нелегальное психоактивное вещество, используемое в рекреационных целях. На данный момент было проведено немного исследований, направленных на изучение механизмов, посредством которых мефедрон воздействует на клетки. В данном исследовании было изучено влияние мефедрона с использованием токсикологии в сочетании с метаболомикой на основе ЖХ/МС/МС на двух клеточных линиях, производных от ЦНС. Методы оценки, такие как анализ с нейтральным красным (NR), бромидом диметилтиазолилдифенилтетразолия (MTT), измерение лактатдегидрогеназы (LDH) и морфология, были использованы для определения влияния на жизнеспособность клеток и для определения оптимальной концентрации для исследования метаболомики. В метаболомическом эксперименте использовалась концентрация мефедрона 100 мкМ, при которой наблюдались значительные внутриклеточные изменения, хотя явных признаков повреждения клеток мефедроном не было. В астроцитах было четко показано, что функция клеточной мембраны может быть нарушена из-за истощения эфирных липидов.
Введение
Мефедрон — это синтетический катинон, замещенный в бензольном кольце, 4-метилметкатинон. Поскольку мефедрон химически схож с амфетаминами, ожидается, что он будет увеличивать концентрации дофамина (ДА) и серотонина (5-НТ) в мозге аналогичным образом, как это делают амфетамины. В данном исследовании токсичность мефедрона на человеческих нейрональных клетках оценивалась с использованием метаболомики. Это первое исследование токсичности мефедрона с использованием метаболомического подхода.
Материалы и методы
Подготовка мефедрона
4,43 мг гидрохлорида мефедрона (чистота более 98%) растворяли в 2% уксусной кислоте (0,5 мл), получая раствор мефедрона 50%, который затем разбавляли в среде для получения других концентраций. Раствор мефедрона хранили при −20 °C до экспериментов.
Извлечение лизатов клеток для метаболомики
В исследовании применялись клетки человеческой астроцитомы (U373) и нейробластомы (SH-SY5Y) из Европейской коллекции клеточных культур. Среду удаляли из лунок, клетки промывали дважды 0,5 мл предварительно нагретого PBS (37 °C). 200 мкл охлажденного экстракционного раствора (50% метанола, 30% ацетонитрила и 20% воды) добавляли в каждую лунку для лизиса клеток. Полученный клеточный раствор переносили в пробирки Eppendorf объемом 0,5 мл. Образцы встряхивали при 4 °C в течение 12 мин, затем центрифугировали при 0 °C и 13000 об/мин в течение 10 мин. Сверхчистую фракцию переносили в стеклянные виалы и хранили при −80 °C до анализа с помощью ЖХ-МС.
Оценка жизнеспособности клеток
Анализ нейтральным красным (NR)
Метод был взят из ранее опубликованного метода (Inoue et al., 2001). После инкубации с мефедроном среду удаляли, и в каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 100 мкл раствора NR (0,05 мг/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS)). Планшет инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 3 ч. Раствор удаляли после инкубации, лунки промывали 200 мкл PBS. Добавляли 100 мкл деколирующего раствора (смесь 50 мл этанола, 1 мл ледяной уксусной кислоты и 49 мл дистиллированной воды), планшет оставляли на шейкере на 30 мин. Поглощение измеряли при 540 нм с помощью спектрофотометра для планшетов (Multiskan GO, Thermo Scientific). Анализ NR является хорошим индикатором роста клеток.
Анализ бромидом диметилтиазолилдифенилтетразолия (MTT)
Анализ MTT проводили в соответствии с методикой (Borenfreund и Puerner, 1985). Раствор MTT 10 мМ готовили в PBS и фильтровали через фильтр 0,2 мкМ. В каждую лунку добавляли 50 мкл раствора после окончания инкубации. Планшет инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 4 часов. После инкубации раствор MTT удаляли и в каждую лунку добавляли 200 мкл ДМСО. Раствор в каждой лунке перемешивали для равномерного окрашивания и переливали в кювету объемом 1 мл. Поглощение измеряли при 540 нм с помощью спектрофотометра для планшетов (Multiskan GO, Thermo Scientific). Анализ MTT является индикатором клеточного метаболизма.
Анализ лактатдегидрогеназы
Анализ LDH основан на способности LDH восстанавливать никотинамидадениндинуклеотид (NAD) до NADH. Это хороший индикатор для оценки повреждения мембраны клеток. NADH будет восстанавливать тетразолиевую соль 2-(4-йодофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-фенил-2H-тетразолий (INT) до красного формазана. Для каждого измерения в кювету (объемом 1 мл) добавляли 0,86 мл 0,1 М буфера фосфата натрия (pH 7,6) и 40 мкл раствора пировиноградной кислоты (3 мг в 1 мл NaPi буфера)/NADH. Затем добавляли 100 мкл среды из каждой лунки. Изменение поглощения регистрировали при 340 нм с помощью УФ-спектрофотометра (UV-2401PC, Shimadzu) в течение 60 секунд при комнатной температуре.
Морфология
Клетки изображали после 6 дней инкубации с мефедроном и без него с использованием микроскопа Motic AE31 с сухими линзами увеличения 20x. Любые изменения в клеточной мембране или внутриклеточных компонентах контролировались.
Результаты
Влияние мефедрона на жизнеспособность, измеренное с помощью анализов MTT, NR и LDH
Анализ MTT
Для изучения влияния мефедрона на клеточную метаболическую активность проводили анализ MTT на обеих клеточных линиях (нейробластома и астроцитома) после обработки различными концентрациями мефедрона в течение 48 часов.
Анализ NR
Обе клеточные линии (нейробластома и астроцитома) обрабатывали различными концентрациями мефедрона в течение 48 часов, и проводили анализ NR для оценки влияния на количество клеток.
Анализ LDH
Из результатов анализа LDH для клеток нейробластомы и астроцитомы после обработки 100 мкМ мефедрона в течение 6 дней можно сделать вывод, что значимых различий в активности LDH между обработанными мефедроном клетками и необработанными в обоих типах клеток не наблюдалось.
Влияние на морфологию
Визуальное исследование под микроскопом обоих типов клеток (нейробластома и астроцитома) до и после обработки 100 мкМ мефедрона в течение 6 дней показало отсутствие признаков аномального размножения после обработки мефедроном.
Метаболомический анализ
Метаболомический анализ обработанных клеток показал значительные изменения в метаболитах в обоих типах клеток после обработки мефедроном.
Метаболомические исследования на клетках нейробластомы после обработки 100 мкМ мефедрона на протяжении 6 дней показали значительные изменения.
Анализ методом ортогонального частичного наименьших квадратов с дискриминацией (OPLS-DA) — хороший параметр для диагностики различий между двумя группами с использованием многомерного анализа. По его результатам можно сделать вывод, что обработка мефедроном привела к значительным изменениям в метаболоме обработанных образцов по сравнению с метаболомом необработанных образцов.
В клетках SH-SY5Y, обработанных мефедроном, наблюдалось значительное увеличение цистеина глутатион дисульфида, который образуется в результате окислительного стресса. Окисление глутатиона приводит к образованию смешанных дисульфидов с тиоловыми группами белков, инициируя обратимое S-глутатионирование. S-глутатионирование важно для передачи сигналов окислителей, отключая фермент эндотелиальную синтазу оксида азота (eNOS) для регулирования его активности в производстве O2•− вместо NO.
Используя модель OPLSDA, удалось разделить обработанные и контрольные образцы, и модель была признана действительной в соответствии с тестом перекрестной проверки и статистикой CVANOVA.
Можно сделать вывод, что обработка мефедроном привела к более значительным изменениям в метаболоме обработанных образцов астроцитомы по сравнению с метаболомом необработанных образцов астроцитомы. Эффекты в этой клеточной линии являются более очевидными, чем в клетках нейробластомы.
Кроме низкомолекулярных метаболитов, наблюдается множество изменений в липидах в астроцитах, вызванных обработкой мефедроном Многие липиды уменьшились в клетках в результате обработки. Это можно увидеть на тепловой карте, где даже некоторые очень распространенные липиды изменились.
Одним из наиболее заметных эффектов на астроциты оказалось воздействие на эфирные липиды, которые не особенно распространены в клетках, но имеют важное значение для текучести мембраны и защитного действия в отношении миелина от окислительного стресса. Некоторые эфирные липиды (LPE 18:1 эфир, ПК 38:5 эфир, LPC 36:4 эфир, ПК 36:3 эфир и ПК 32:1 эфир) в клетках были практически полностью истощены. У мышей и человеческих пациентов с дефицитом эфирных липидов развивались проблемы с миелинизацией в ЦНС.
Несколько липидов были уменьшены. Глицерофосфолипиды являются основным компонентом клеточной мембраны. Считается, что клетки изменяют клеточную мембрану в качестве защитной реакции при воздействии экстрацеллюлярных токсичных соединений. Глицерофосфохолины контролируют баланс между концентрацией растворенных веществ внутри и снаружи клетки. Предыдущее исследование показало, что уровни ПК уменьшились в мозге мыши после обработки антидепрессантами (пароксетином и мапротилином). В другом исследовании снижение глицерофосфолипидов было связано с окислительным стрессом и изменениями в липидной мембране клетки. Предполагается, что окислительный стресс повлиял на состав клеточной мембраны в клетках, обработанных мефедроном.
Интересно, что окислительный стресс, вызванный хроническим непредсказуемым стрессом, был показан как фактор, нарушающий уровни фосфолипидов в мозге мыши. В другом исследовании, проведенном на гиппокампе и префронтальной коре крыс, четыре недели хронического непредсказуемого стресса привели к значительному снижению уровней ПЭ. Окислительный стресс вызывает окисление липидов, что ведет к изменению липидного баланса, связанного с неврологическими расстройствами. Окисление липидов приводит к дестабилизации мембраны клеток и затем к гибели клеток. Это исследование предполагает, что мефедрон может снижать глицерофосфохолин из-за окислительного стресса, поскольку эффекты мефедрона ранее были связаны с окислительным стрессом.
Другие измененные мембранные липиды включают глицерофосфолипиды (ФГ), фосфатидилсерины (ФС) и сфингомиелины (СМ), которые также уменьшились. Все эти липиды являются частью клеточной мембраны, поэтому снижение этих липидов является признаком повреждения мембраны. Несколько лизофосфолипидов также были изменены. Поскольку известно, что лизофосфолипиды имеют нейропротективную роль, любое их снижение повлияет на защитные способности нейронов.
Кроме того, сфингомиелины также были затронуты обработкой. Сфингомиелин 36:2 уменьшился, и это тип сфинголипида, находящегося в миелиновой оболочке мембраны, которая покрывает аксон нервной клетки.
Три сфинганина уменьшились, и они играют роль в блокировании этерификации липопротеина низкой плотности холестерола, что приводит к накоплению неэтерифицированного холестерола в перинуклеарных везикулах. Сфинганины являются эффективным сигнальным липидом или липидным мессенджером, который прикрепляется к целевому белковому рецептору, что способствует функции липида в определенных ответах клетки. Можно сделать вывод, что снижение сфинганинов повлияет на липидную сигнализацию в клетке.
Девять жирных кислот были затронуты, две увеличились, а семь уменьшились. Астроциты (представленные клетками астроцитомы) отвечают за перенос жирных кислот из плазмы в мозг и являются единственными клетками в мозге, которые могут окислять жирные кислоты и на самом деле предпочитают их в качестве топлива. Любой сбой в работе астроцитов приведет к нарушению уровней жирных кислот в мозге, а любое снижение уровней жирных кислот приведет к снижению функции астроцитов. Мефедрон может вызвать нарушение уровней жирных кислот в астроцитоме. Поскольку астроциты обеспечивают другие клетки мозга глюкозой и кетоновыми телами за счет своей способности окислять жирные кислоты, любое воздействие на них приведет к снижению энергоснабжения других клеток мозга.
Три метаболита карнитина уменьшились. Это L-карнитин, бутенилкарнитин и гидроксибутирилкарнитин. Карнитины имеют очень важную роль в обеспечении клеток энергией и жизненно важны для метаболизма жирных кислот.
Менаквинол-8 или витамин K2 уменьшился, что играет роль в регуляции свертываемости крови. Витамины K имеют одинаковую структуру метилированного нафтохинонового кольца и отличаются только типом боковой алифатической цепи, связанной на позиции 3.
Два гликогена увеличились в результате обработки. Гликоген — основной продукт запасания глюкозы в человеческих клетках. Гликоген находится в гранулярных структурах в цитозоле. Предполагается, что клетки произвели больше гликогена для компенсации потери энергии в условиях повреждения мембраны. В мозге гликоген преимущественно находится в астроцитах, где он служит источником энергии для защиты мозга от гипогликемии.
Другие метаболиты, связанные с метаболизмом глутамата, такие как 2-оксоглутарат, L-2-аминоадипат и D-глюкозамин-6-фосфат, также изменились. Окисленный глутамат (оксоглутарат) уменьшился на 60%, а другие увеличились. Аминоадипат, который был увеличен, является антагонистом возбуждающего эффекта глутамата и является метаболитом лизина. Глутамат является важным нейротрансмиттером, ответственным за быстрый возбуждающий эффект в мозге. L-аспарагин, который уменьшился, является метаболитом глутамата. Однако, мы не можем сделать вывод о влиянии на уровень глутамата, так как его уровень не изменился значительно.
Два метаболита, связанных с путями триптофана и серотонина, уменьшились. 5-гидроксииндолацетат является метаболитом нейротрансмиттера серотонина. Индоллактат также уменьшился, и это метаболит триптофана, предшественника серотонина и мелатонина. Однако мы не смогли обнаружить серотонин или триптофан в нашем методе.
Никотинамид и NADH также изменились с значимыми значениями p. NADH уменьшился, а никотинамид увеличился. Никотинамид играет важную роль в защите нейронов, так как предварительная обработка никотинамидом обратила вспять гипоксию в гиппокампе крыс. Таким образом, мы делаем вывод, что одним из механизмов защиты клеток астроцитомы является производство никотинамида для защиты их самих и нейронных клеток от окислительного стресса, вызванного обработкой мефедроном.
Обсуждение
В тесте MTT оба типа клеток показали увеличение метаболической активности после обработки мефедроном. Клетки SH-SY5Y не показали увеличения в анализе NR в лунках с 100 мкМ. Напротив, в клетках U-373 наблюдалось увеличение активности для обоих анализов (NR и MTT), с более высоким увеличением метаболической активности. Это можно объяснить дополнительной защитной способностью U-373 увеличивать количество клеток, так как они представляют астроциты, которые играют роль в защите нейронных клеток.
Анализ NR не показал значимого влияния мефедрона на скорость роста клеток SH-SY5Y. Для клеток U-373 наблюдалось постепенное увеличение количества клеток по мере увеличения концентрации мефедрона до 300 мкМ. Рост клеток начал снижаться при концентрациях мефедрона 400 мкМ и 500 мкМ.
Измерение высвобождения LDH является хорошим индикатором повреждения клеток и целостности клеточной мембраны. Поскольку результаты показали, что не было значимого увеличения в обоих типах клеток, мы можем сделать вывод, что мефедрон при этой концентрации и времени воздействия не оказал сильного влияния на целостность клеточной мембраны в этих клетках.
Мы можем заключить из исследования морфологии, что не было значительных изменений в форме клеток в результате воздействия мефедрона при данной концентрации и времени экспозиции как в клетках SH-SY5Y, так и в клетках U-373. Это находится в противоречии с результатами исследования Холландера, особенно в клетках SH-SY5Y при концентрации 500 мкМ. Однако методология, используемая в исследовании Холландера, отличалась (использовался анализ WST-1), что также может быть объяснено различиями в числе пассажей, поскольку Холландер проводил исследование на клетках от 6 до 20 пассажей, в то время как в данном исследовании использовались клетки на пассажах выше 35.
Общее впечатление после метаболомического анализа заключается в том, что мефедрон не оказал сильного воздействия на клетки SH-SY5Y при этих концентрациях. Либо мефедрон воздействует на определенный тип клеток, отличный от нейробластомы, либо данная концентрация мефедрона не способна вызвать значимое воздействие на эту клеточную линию. Изменения метаболитов носят случайный характер и не вписываются в какой-либо конкретный путь, при этом изменения величин обычно невелики.
Также стоит отметить, что данные клеточные линии (SH-SY5Y) теряют свои дофаминергические способности после 20 пассажей, а анализ проводился на 35 и более пассажах, что делает эти клетки менее репрезентативными для нейронных клеток. Увеличение метаболической активности, наблюдаемое в результате анализа MTT (Рисунок 1), можно объяснить возможным увеличением специфических белков, которые не обнаруживаются метаболомическим анализом.
В клетках астроцитомы основное воздействие было оказано на липидный путь, особенно на липиды клеточной мембраны. Это открытие может помочь понять воздействие мефедрона на мозг, особенно на гематоэнцефалический барьер (астроциты). Воздействие на астроциты как важную часть мозгового барьера повлияет на нейроны, так как астроциты известны своей защитной ролью по отношению к нейронным клеткам. Однако мефедрон не оказал сильного цитотоксического эффекта при этой концентрации, хотя и вызвал изменения в метаболоме клеток ЦНС, что не отвечает за его токсичность в организме, так как количество клеток, как показано результатами анализа NR, не уменьшилось.
Метаболомический анализ подтвердил, что после обработки клеток SH-SY5Y и U373 мефедроном в концентрации 100 мкМ произошли изменения метаболизма, что согласуется с результатами анализа MTT. Результаты метаболомики обоих типов клеток предполагают увеличение концентрации глутамина после обработки мефедроном. Появление цистеинглутатион дисульфида в клетках SH-SY5Y после обработки мефедроном указывает на наличие окислительного стресса. Воздействие мефедрона было гораздо более заметным на клетках U373.
Заключение
Из анализа различных типов клеток очевидно, что, хотя мефедрон не убил клетки и не уменьшил их рост, он вызвал значительные внутриклеточные метаболические изменения. Считается, что даже небольшие изменения в гомеостазе клеток мозга могут привести к неврологическим заболеваниям. Хотя явных признаков клеточного повреждения, вызванного мефедроном, не было, в астроцитах было четко указано, что функция клеточной мембраны могла быть нарушена из-за истощения эфирных липидов. Рекомендуется использовать более высокие концентрации мефедрона на тех же клеточных линиях в будущем метаболомическом исследовании, чтобы лучше исследовать токсический эффект мефедрона.